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Lo que debes saber sobre las técnicas de análisis de proteínas

Las proteínas, también conocidas como polipéptidos, son compuestos orgánicos formados por aminoácidos. Son moléculas grandes y complejas que desempeñan muchas funciones críticas en el cuerpo.


Las proteínas están formadas por cientos de miles de unidades más pequeñas que se organizan en una cadena lineal y se pliegan en forma globular. Hay 20 tipos diferentes de aminoácidos que se pueden combinar para formar una proteína y la secuencia de aminoácidos determina la estructura tridimensional única de cada proteína y su función específica.




Las proteínas hacen la mayor parte del trabajo en las células y son necesarias para la estructura, función y regulación de los tejidos y órganos del cuerpo. Partes esenciales de los organismos, participan en prácticamente todos los procesos dentro de las células. Muchas proteínas son enzimas que catalizan reacciones bioquímicas y son vitales para el metabolismo. El tamaño de una proteína es una característica física importante y los científicos a menudo usan analizadores de tamaño de partículas en sus estudios para discutir el tamaño de la proteína o el peso molecular.


Estructura de las proteínas

Para poder realizar su función biológica, las proteínas se pliegan en una o más conformaciones espaciales específicas impulsadas por una serie de interacciones no covalentes como enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y empaquetamiento hidrófobo. Esta comprensión es el tema del campo científico de la biología estructural, que emplea técnicas tradicionales como la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de RMN y la espectrometría de dicroísmo circular para determinar la estructura de las proteínas.


La mayoría de las proteínas se pliegan en estructuras tridimensionales únicas. La forma en la que una proteína se pliega de forma natural se conoce como su conformación nativa. Si bien la mayoría de las proteínas pueden plegarse sin ayuda gracias a las propiedades químicas de sus aminoácidos, otras requieren la ayuda de chaperonas moleculares. Hay cuatro aspectos distintos de la estructura de una proteína:

  • Estructura primaria : la secuencia de aminoácidos.

  • Estructura secundaria : Estructuras locales que se repiten regularmente y estabilizadas por enlaces de hidrógeno.

  • Estructura terciaria : la forma general de una sola molécula de proteína; la relación espacial de las estructuras secundarias entre sí.

  • Estructura cuaternaria : estructura formada por varias moléculas de proteínas que funcionan como un solo complejo proteico.


Las estructuras de proteínas varían en tamaño desde decenas hasta varios miles de aminoácidos. Por tamaño físico, las proteínas se clasifican como nanopartículas, entre 1 y 100 nm. Se pueden formar agregados muy grandes a partir de subunidades de proteínas. Por ejemplo, muchos miles de moléculas de actina se ensamblan en un microfilamento.


Técnicas de análisis de proteínas

Las proteínas se diferencian entre sí según el tipo, número y secuencia de aminoácidos que componen la estructura polipeptídica. Por tanto, tienen diferentes estructuras moleculares, atributos nutricionales y propiedades fisicoquímicas.

Hay tres técnicas principales de análisis de proteínas: separación de proteínas, transferencia de Western y identificación de proteínas.

1. Separación de proteínas

La electroforesis de proteínas es el proceso de separar o purificar proteínas colocándolas en una matriz de gel y luego observando la movilidad de las proteínas en presencia de un campo eléctrico. Es un enfoque importante para estudiar la función de las proteínas y el efecto de una proteína en particular en el desarrollo o una función física al introducirla en un organismo.


La técnica más utilizada para la separación de proteínas es la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Las proteínas se pueden separar según su solubilidad, tamaño, carga y afinidad de unión. SDS-PAGE separa proteínas principalmente sobre la base del peso molecular en oposición a la carga o el plegamiento. Es una técnica que se usa ampliamente en bioquímica, medicina forense, genética y biología molecular.

Otros métodos incluyen:

  • Enfoque isoeléctrico : en este método, diferentes moléculas se separan por sus diferencias de carga eléctrica. Esta técnica es un tipo de electroforesis de zona que se suele realizar en gel y aprovecha que la carga de una molécula cambia con el pH de su entorno.

  • Métodos cromáticos : Hay dos métodos cromáticos que se utilizan con frecuencia para la separación de proteínas: cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía en capa fina. Ambos métodos son complementos particularmente útiles de los enfoques basados ​​en gel. Aunque la cromatografía es una técnica común en los laboratorios de bioquímica que se utiliza para la purificación, identificación y cuantificación de mezclas de proteínas, la difracción láser se utiliza tradicionalmente para el tamaño de la precolumna y la gestión de la polidispersidad.

  • Electroforesis en gel bidimensional : este es un poderoso método basado en gel que se usa comúnmente para analizar muestras complejas con el fin de caracterizar la gama completa de proteínas en la muestra, no solo unas pocas proteínas específicas.

2. Western Blot

La técnica de Western Blot utiliza tres elementos para identificar proteínas específicas de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y marcación de la proteína diana utilizando un anticuerpo primario y secundario adecuado para visualizar.

La versión más común de este método es la inmunotransferencia . Esta técnica se utiliza para detectar proteínas específicas en una muestra determinada de homogeneizado o extracto de tejido. La muestra de proteínas se somete primero a electroforesis mediante SDS-PAGE para separar las proteínas en función del peso molecular. Las proteínas luego se transfieren a una membrana donde se sondean utilizando anticuerpos específicos para la proteína diana.

3. Identificación de proteínas

Hay dos métodos que se utilizan comúnmente para identificar proteínas: la degradación de Edman y la espectrometría de masas.

Desarrollado por Pehr Edman, Edman Degradation es un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido. Aquí, el residuo amino-terminal se marca y se escinde del péptido sin interrumpir los enlaces peptídicos entre otros residuos de aminoácidos.

La espectrometría de masas de proteínas es una técnica analítica que mide la relación masa / carga de partículas cargadas para determinar las masas de partículas y la composición elemental de una muestra de moléculas, así como para dilucidar la estructura química de moléculas como los péptidos. La espectrometría de masas de proteínas es un método importante para la determinación y caracterización de masas precisas de proteínas, y se han desarrollado una variedad de métodos e instrumentaciones para sus múltiples usos. La aplicación de la espectrometría de masas para estudiar proteínas se popularizó en la década de 1980 después del desarrollo de MALDI y ESI. Estas técnicas de ionización han jugado un papel importante en la identificación de proteínas. La identificación se puede realizar a través de:

  • Huella peptídica Este método utiliza las masas de péptidos proteolíticos como entrada para una búsqueda de una base de datos de masas predichas que surgen de la digestión de una lista de proteínas conocidas. La principal ventaja de este método es que no depende de la secuenciación de proteínas para la identificación de proteínas. La limitación de este método es que requiere que la base de datos tenga la proteína que ya está caracterizada en otro organismo.

  • Secuenciación de péptidos de novo En este caso se realiza sin conocimiento previo de la secuencia de aminoácidos. Este método puede obtener las secuencias de péptidos sin una base de datos de proteínas y utiliza enfoques computacionales para deducir la secuencia de péptidos directamente de los espectros experimentales de MS / MS. Puede utilizarse para organismos no secuenciados, anticuerpos, péptidos con modificaciones postraduccionales (PTM) y péptidos endógenos.


Fuente: https://www.atascientific.com.au/3-protein-analysis-techniques/


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